12/09/2008

Reactivos Químicos para Técnica Histológica



La técnica histológica es una metodología empleada en laboratorios de histología animal y vegetal, que permite realizar un preparado histológico para su observación microscópica y diagnóstico. El componente teórico del presente trabajo se encuentra integrado con otros conceptos fundamentales de referencia tomados, en particular, de Wikipedia a fin de profundizar la temática.



por Víctor Hugo Tomasi



Reactivos usados en Técnica Histológica.


Los reactivos químicos son sustancias que imprimen determinadas cualidades en la muestra biológica en estudio, las cuales favorecen su procesamiento sin modificar las estructuras histológicas que la componen. Los reactivos se agrupan de acuerdo a la función química que ejercen sobre el tejido y depende del grupo funcional que se enlaza a la molécula.

Este grupo funcional está representado por un átomo o conjunto de átomos que confiere al reactivo químico propiedades especiales inherentes a su presencia. Por ejemplo, el alcohol etílico, función química, es empleado para extraer las moléculas de agua existentes en la intimidad del tejido. Este proceso de deshidratación se produce debido a la presencia del grupo funcional “hidroxilo”:





El alcohol etílico es, por tanto, un agente deshidratante de la muestra en estudio que elimina el agua a través de su grupo funcional vía puentes hidrógeno. Tal procedimiento permite la posterior inclusión de la muestra en parafina (medio de inclusión hidrofóbico).



Por otra parte, el alcohol etílico también se puede emplear como reactivo fijador tras obtener la muestra, ya que la extracción de las moléculas de agua a partir del tejido provoca la coagulación de proteínas estructurales y solubles, deteniendo los procesos posmortem del tejido. De esta manera, debemos entender que alcohol etílico es un reactivo químico que se puede utilizar para deshidratar o fijar un espécimen. En otras palabras es común emplear, en técnica de rutina, una serie preparada con alcohol etílico en graduación creciente para deshidratar la muestra biológica, la que será incluida en parafina. Este alcohol es utilizado, además, al 95% para fijar extendidos celulares.

Analicemos otro ejemplo, el ácido pícrico se obtiene por acción del ácido nítrico sobre el fenol, tras lo cual quedan incorporados tres grupos nitro (I). De acuerdo a Dehn & Ball (1917), el ácido pícrico en solución también presenta una forma tautomérica (II) y ambas son reactivas con el tejido.

Los grupos funcionales señalados (hidroxilo, nitro, quininoide y carbonilo) hacen que el ácido pícrico se lo pueda utilizar en técnica histológica en diferentes procedimientos:

1. Extrae Ca++ a partir de tejidos calcificados (origina Picrato de calcio).

2. Fija muestras biológicas por inhibición de los procesos autolíticos (Mezcla de Bouin).

3. Colorea diversas proteínas citoplasmáticas (Tinción de Van Gieson).


De esta manera, el ácido pícrico se puede emplear como reactivo descalcificante, fijador o colorante y ello depende del objeto de estudio.


Clasificación

Fijadores: tienen la propiedad de detener las funciones vitales de células y tejidos, inhibiendo además, los fenómenos autolíticos de necrosis, los cuales llevan a la distorsión de la arquitectura del tejido. Estas sustancias no pueden actuar como fijadores si son capaces de atacar las uniones peptídicas. Lejos de ser proteolíticos, los fijadores tienden a unir las cadenas proteicas próximas y, de esta manera, dar estabilidad mecánica. Ejemplos: formol, metanol, cloruro de mercurio, etc.


Aclarantes: son agentes que confieren un elevado índice de refracción al tejido (nD = 1.53), de manera tal, que sería dificultoso distinguir una estructura histológica de otra si éstas no son coloreadas previamente. Ejemplos: xileno, tolueno, benceno, alcohol bencílico, acetato de butilo, glicerina, etc. El xileno, benceno y tolueno se conocen también como reactivos Intermediarios, ya que se emplean entre la deshidratación de la muestra y su impregnación con parafina.

Opacantes: presentan bajo índice de refracción y se emplean para hacer más perceptibles diferentes estructuras histológicas cuando se las observan con microscopía de fase. Ejemplos: soluciones de Tyrode y Ringer.

Descalcificantes: son agentes que extraen el calcio del tejido por mecanismos de precipitación y quelación. Esto provoca el ablandamiento de la muestra, lo cual favorece el corte ulterior con micrótomo. Ejemplos: los ácidos nítrico, tricloroacético, pícrico, fórmico o acético. El etilendiaminotetracético di sódico y el citrato de sodio son quelantes.

Diferenciantes: se utilizan para aumentar la selectividad de la coloración o para eliminar tinciones de fondo inespecíficas, después que los cortes histológicos han sido coloreados. Ejemplos: ácido acético, agua sulfurosa, la mezcla etanol/clorhídrico, los ácidos fosfotúngstico y fosfomolíbdico.

Conservadores: se usan para mantener en condiciones óptimas todo material biológico que se desea guardar durante tiempos prolongados (archivo y piezas anatómicas de museo). Ejemplo: formol, las sales de potasio, glicerina, los medios de montaje, aceite de cedro, etc.

Colorantes: son sustancias que imprimen distintos matices de color al tejido, los cuales permiten identificar las diferentes estructuras histológicas cuando se las observan al microscopio. Ejemplos: Orange G, Verde de metilo, Eosina, Azul de metileno, Fucsina ácida, Galocianina, etc.

Aislantes: estos compuestos se utilizan cuando se desean separar tejidos, células o sus diferentes componentes al disolver las estructuras que los mantienen unidos. Ejemplos: hidróxido de potasio al 5%, tripsina, colagenasa, proteinasa K, etc.

Deshidratantes: son agentes que se utilizan para eliminar el agua del tejido. Ejemplos: etanol, metanol, butanol, acetato de butilo y acetona.

Indiferentes: son sustancias químicas que actúan como vehículo del reactivo principal o que permiten adecuar el medio a las condiciones fisiológicas. Ejemplos: cloruro de sodio, sulfato de potasio, cloruro de calcio, soluciones buffer (ver más abajo).

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Referencias:

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12/02/2008

Soluciones Buffer

por Víctor Hugo Tomasi


Tal como nos señala Charlotte Avers (1), la vida depende del agua. Las células generalmente contienen de un 60% a 95% de agua. El agua tiene propiedades importantes que la hacen excepcionalmente adecuada como medio para las actividades celulares.

Las moléculas de agua existen como unidades polares, cuyos electrones compartidos están más cerca del núcleo de oxígeno que del hidrógeno. De esta manera, las moléculas de agua son dipolos; es decir, presentan carga neta positiva en el extremo de la molécula que lleva los dos hidrógenos y la carga neta negativa se ubica en el extremo del oxígeno.


El agua disuelve una cantidad considerable de casi cualquier molécula que tenga una carga neta o bien grupos polares, en especial, dipolos. Cualquier parte de una molécula con su nube de electrones distribuida asimétricamente o con un dipolo permanente, tal como -OH, es probable que sea muy soluble en agua debido a las fuerzas de atracción producidas entre ellas. Los enlaces de hidrógeno u otros enlaces no covalentes se forman, generalmente, entre las moléculas de agua de la fase solvente (o disolvente) y las moléculas de soluto (o disuelto) que se añaden al agua. El grado relativo de solubilidad depende de cuántos enlaces agua-agua puedan alterarse, cuando los enlaces agua-soluto los reemplacen.

Generalmente, los enlaces agua-agua son más favorecidos, debido a que el sistema se encuentra en estado de menor energía comparado con los enlaces agua-soluto. Por ello, muchos compuestos tienen solubilidad limitada en agua. Los compuestos que con facilidad forman enlaces con las moléculas de agua son hidrofílicos. Los compuestos hidrofóbicos no pueden formar fácilmente enlaces de hidrógeno con el agua y, por tanto, son poco o nada solubles en ese medio.

Cuando una molécula no polar, como el xilol, se mezcla con el agua hay una rápida separación de las moléculas de agua y de xilol. El agua forma enlaces hidrógeno entre ellas, mientras que las del xilol se unen entre sí por interacciones hidrofóbicas u otras fuerzas más débiles. Las moléculas hidrófobas están separadas con efectividad en el espacio de las moléculas de agua. Cada compuesto existe en su propio espacio y no se mezcla con el otro. Si algún grupo con carga eléctrica, por ejemplo un residuo fosfato, se añade a una molécula hidrófoba, ésta será más fácilmente soluble en agua. El aumento de la solubilidad se debe a una mayor capacidad para la formación de enlaces de hidrógeno y otros enlaces entre el residuo cargado eléctricamente y las moléculas dipolares de agua.

Teniendo en cuenta que las moléculas de agua son dipolares, una o sus dos regiones cargadas pueden unirse, dependiendo de la carga o cargas particulares de las moléculas de soluto. En este sentido, no hay dudas de que el agua es un solvente muy eficaz para los iónes con carga eléctrica o para las moléculas inorgánicas electrocargadas, aún cuando se hallen en estado cristalino.

Escala de pH: El agua puede aumentar la disociación de sustancias tales como ácidos o bases débiles, que ya existen parcialmente disociados o en forma ionizada. Aunque la disociación del agua se expresa de manera convencional como H2O Û H+ + OH-, el ión H+ libre no se encuentra como tal. En realidad, el agua se disocia en H3O+ (ión hidronio) y OH- (ión oxidrilo). Sin embargo, a los fines prácticos, esto puede ignorarse y los iones H+ y OH- son considerados como producto de disociación del agua. La disociación del agua es un proceso en equilibrio a temperatura constante y puede expresarse como:


Keq = [H+ ] [OH-]

[H2O]

Keq es la constante de equilibrio. La concentración de las moléculas de agua y sus componentes ionizados se expresan en moles por litro. La concentración molar (M) del agua en estado puro es de 55,5 M (gramos correspondientes a un litro de agua dividido el peso molecular del agua, o sea, 1000/18). Las concentraciones de los iones H+ y OH- en el agua son muy bajas (10-7 M a 25ºC). Por tanto, podemos simplificar la constante de equilibrio a 55,5 x Keq = [H+ ] [OH-]. El término 55,5 x Keq, se denomina producto iónico del agua, o constante Kw.

Kw = [H+ ] [OH-]


Kw es la base para la escala de pH. El término pH (potencial de hidrogeniones) se define como:

pH = - log10 [H+ ]


Es conveniente utilizar una escala logarítmica para los valores de pH, debido a las amplias variaciones en la concentración de los iones H+. Se usa el logaritmo negativo de base 10, de modo que pueda obtenerse una escala de lecturas positivas. En una solución precisamente neutra a 25ºC, [H+ ] = [OH-] = 1 x 10-7 M, y el pH de dicha solución es:


pH = - log10 [H+ ] = - log10 (10-7) = 7.0


El valor 7.0 de pH para una solución neutra se obtiene del producto iónico del agua a 25ºC y no de un estándar arbitrario. En una solución ácida, el pH es inferior a 7.0, ya que la concentración de los iones H+ es alta. Por el contrario, en una solución alcalina el pH es mayor que 7.0 porque la solución tiene una baja concentración de iones H+. Las mediciones de concentración de iones H+ se hacen utilizando un medidor de pH (potenciómetro de H+).


Las actividades celulares son extremadamente sensibles a cambios ligeros del pH interno, principalmente, porque la actividad enzimática se ve afectada por la concentración de los iones H+. Una enzima tiene su máximo de actividad a un pH característico llamado pH óptimo y su actividad declina bruscamente tanto por arriba como por debajo de ese valor óptimo. Los efectos notables del pH sobre la unión enzima-sustrato o antígeno-anticuerpo in vivo o in vitro reflejan variaciones eléctricas en la superficie de las moléculas reactantes. Dichas variaciones conducen a un cambio estereoquímico de dichas moléculas y a una actividad reducida o nula cuando los valores son inadecuados.

Las variaciones en fracciones pequeñas de una unidad de pH pueden ser nocivas o aún letales para algunas células o inadecuadas para las reacciones enzimo e inmunohistoquímicas sobre cortes de tejidos empleadas en técnica histológica. Estas fluctuaciones en el pH son moduladas por la potente acción reguladora de donadores de protones (H+) (ácidos) y aceptores de H+ (bases) que están presentes en los líquidos intra o extracelulares de los organismos vivos. Los sistemas reguladores o buffer tienden a resistir cambios en el pH, adicionando o tomando iones H+ u OH-. El principal sistema buffer del plasma sanguíneo de los vertebrados es el par donador-aceptor ácido carbónico-bicarbonato:


H2CO3 - HCO3-



El pH del plasma sanguíneo humano es regulado a un valor de 7.4. Puede ocurrir daño irreparable si el pH del plasma cae por debajo de 7.0 o se eleva a más de 7.8. La diferencia entre el pH 7.4 y 7.8 en la sangre refleja un cambio en la concentración de los iones H+ de sólo 3 x 10-3 M. La pequeña magnitud de este cambio destaca la importancia de los mecanismos buffer de pH como moduladores de acidez y alcalinidad de los líquidos celulares.

Del mismo modo, durante cualquier reacción enzimo o inmunohistoquímica, las moléculas reactantes se acoplarán si la concentración de iones H+ es adecuada. La unión de estas moléculas se produce a través de enlaces no covalentes y fuerzas intermoleculares, las que se verán entorpecidas si la concentración de iones H+, por tanto pH, no es el correcto. Ajustar el pH de nuestras soluciones, empleadas para la preparación de antisueros, sustratos, baños de lavado, reactivos fijadores, etc., es imprescindible para obtener resultados confiables.

Las soluciones buffer utilizadas en nuestro laboratorio para la preparación de diferentes reactivos son variadas. En bibliografía se reportan distintas fórmulas de preparación y las correspondientes Tablas de pH, cada una de ellas se debe ajustar al objeto de estudio. A continuación de describirá la Solución Buffer de Fosfatos (PBS) a modo de ejemplo, con el propósito de integrar los siguientes conceptos: soluciones, concentración, pH y estequeometría.


Preparar 200 ml de PBS 0.1 M, pH 7.4. Si leemos detenidamente esta consigna, los datos que aparecen se refieren a que: los 200 ml es el volumen final de la solución que necesitamos para trabajar; PBS, por supuesto, es la sigla que designa que nuestra solución se debe realizar con sales de fosfatos (por ejemplo, fosfato diácido de sodio y fosfato ácido de sodio); 0.1 M hace referencia a la concentración de esas sales por litro de disolvente (agua destilada) y pH a la concentración de iones H+. Este pH, si bien se lo puede calcular matemáticamente, contamos con la ventaja que ya se encuentra tabulado en bibliografía y, para ello, debemos mezclar las soluciones madres de las dos sales citadas con anterioridad. Si observamos las siguientes fórmulas podemos constatar que estas sales de fosfatos están compuestas por varios átomos:


1) NaH2PO4 . H2O PM 137,99

2) Na2HPO4 PM 29,39


Si ubicamos esos átomos en la Tabla Periódica conoceremos los pesos atómicos de cada uno, luego sumamos esos pesos atómicos relativos para cada sal y obtendremos los pesos moleculares (PM) de cada una.

Por otro lado, M es la letra que, en Soluciones Químicas, significa concentración Molar y representa la fuerza iónica del buffer. Se entiende por Molaridad al “número de moles que hay en 1000 ml de solución”. En química se dice que 1 mol de cualquier sustancia es igual al peso molecular (PM). Nuestro buffer de trabajo lo debemos preparar con una concentración de 0,1, por tanto y de acuerdo a las formulaciones de García del Moral (2), necesitamos pesar 27,59 gr y 29,39 gr de cada sal, respectivamente. Luego, por separado, disolvemos las sales con agua destilada en matraces aforados hasta 1000 ml. En el momento de usar mezclamos 19 ml de solución de fosfato diácido de sodio, 81 ml de solución de fosfato ácido de sodio y agregamos 100 ml de agua destilada. De esta manera, tenemos 200 ml de PBS 0.1 M, cuyo pH es 7,4.

Ahora bien, si leemos nuevamente esta preparación, determinaremos que tras mezclar las dos soluciones salinas volvemos a agregar 100 ml de agua destilada. Aquí nos preguntamos si este agregado de agua influye en la concentración final del PBS. La respuesta a este interrogante es sí, influye. Lo que sucede es que: 1. la concentración del PBS solicitado debe ser 0.1 M y 2. la cantidad de drogas pesada de cada sal (27,59 gr y 29,39 gr) y disueltas en 1000 ml de agua, corresponden a una concentración final de 0.2 M.

Es por ello que, tras mezclar las dos soluciones salinas 0.2 M, obtenemos un volumen de 100 ml y para bajar al doble la concentración de buffer, o sea a 0.1 M, necesitamos aumentar al doble el volumen final (200 ml) de toda la mezcla con agua destilada.


Con este ejemplo de buffer hemos trabajado soluciones molares que son las más comunes. Sin embargo, existen otras formas de expresar la concentración de una solución.

Se usan soluciones de concentraciones porcentuales: %P/V, %P/P y %V/V, la más empleada es %P/V. Todas se refieren a la cantidad de soluto, sean drogas sólidas o líquidas, disuelta en 100 partes de disolvente. Por otro lado, están las concentraciones químicas: Normales (N), Molales (m) y Molares (M). Todas pueden emplearse, pero las utilizadas rutinariamente son la N y M.

Por “N” se entiende a la cantidad de equivalentes químicos que hay en 1000 ml de solución y por “m” se define a la cantidad de moles que hay en 1000 gr de disolvente.


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VHT

(1). Avers, Charlotte J., (1991). Biología Celular, Capítulo 2, Las Moléculas Orgánicas. 2da. Edición, Grupo Editorial Iberoamericana.

(2). Raimundo García del Moral. (1993). Laboratorio de Anatomía Patológica. Apéndices A y B. Editorial Interamericana, Mc Graw-Hill.